茚三酮比色法 氨基酸含量的测定

茚三酮显色法测定氨基酸含量

原理

茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。

试剂与材料

1.标准氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L溶液。

2.pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液：量取86mL 2mol/L醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L乙酸混合而成。用pH检查校正。

3.茚三酮显色液：称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10mL乙二醇甲醚溶解。

茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g茚三酮溶于15～25mL热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻搅拌。加热30min后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。

还原型茚三酮按下法制备：称取5g茚三酮，用125mL沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将5g维生素C用250mL温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，不断出现沉淀。滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4℃，过滤、沉淀用冷水洗涤3次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。

乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物：在500mL乙二醇甲醚中加入5g硫酸亚铁，振荡1～2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121～125℃的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。

4.60％乙醇。

5.样品液：每毫升含0.5～50μg氨基酸。 6.分光光度计。 7.水浴锅。 操作步骤

1．标准曲线的制作

分别取0.3mmol/L的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试管中，用水补足至1mL。各加入1mL pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液；再加入1mL茚

三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min后，加入3mL 60％乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。

以OD570nm为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。 2．氨基酸样品的测定

取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液1mL和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加3mL 60％乙醇稀释，摇匀后测定OD570nm（生成的颜色在60min内稳定）。

将样品测定的OD570nm与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。 结果计算

氨基酸含量（mmol/L）= OD——对应标准曲线查得值。

OD570nm 1 000