重组人胰岛素制备工艺

第３９卷第４期　四川大学学报（工程科学版）　Ｖ０１．３９　Ｎｏ．４　２００７年７月　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＳＩＣＨＵＡＮ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（ＥＮＧＩＮＥＥ￣ＮＧ　ＳＣＩＥＮＣＥ　ＥＤＩＴＩＯＮ）　Ｊｕｌｙ　２００７　文章编号：１００９—３０８７（２００７）０４－００７９－０５　重组人胰岛素制备工艺　李晓红，朱惠玲，余　蓉，李红霞　（四川大学华西药学院，四川成都６１００４１）　摘要：为了提高重组人胰岛素的表达量，用Ｅ　ｃｏｌｉ发酵表达（Ｈｉｓ）　一Ａｒｓ—Ａｒｇ一人胰岛素原［（Ｈｉｓ）　一Ａｒｓ—Ａｒｇ　ｈｕｍａｎ　ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ，ＲＲｈＰＩ］，并对影响ＲＲｈＰＩ高效表达的各主要因素以及下游纯化工艺的各关键步骤进行优化。　研究表明，ＲＲｈＰＩＥ　ｃｏｌｉ在最优培养基：５　ｇ／Ｌ胰蛋白胨，２　ｇ／Ｌ谷氨酸，７　ｇ／Ｌ酵母浸膏，０．５　ｇ／Ｌ酸铵，２．５　ｇ／Ｌ葡萄　糖，２．７　ｇ／Ｌ甘油，１００　ｍｇ／Ｌ氨苄青霉素，５０　ｍｇ／Ｌ卡那霉素，ｐＨ　７．２的条件下，用发酵罐进行发酵，在对数生长中期　加入０．５　ｍｍｏ￣Ｌ　ＩＰＴＧ诱导４　ｈ，发酵过程中通过补料和转速调节，每升培养基能收获湿菌体５１．２　ｇ，包涵体１６．２　ｇ。在下游纯化工艺中，初步纯化前包涵体溶解液中一定浓度的Ｂ一巯基乙醇以及复性液中一定浓度的氧化型谷胱　甘肽将有助于ＲＲｈＰＩ的复性。经过工艺条件的优化，人胰岛素最终收率可达７４　ｍｇ／Ｌ培养基。　关键词：（Ｈｉｓ）　一Ａｒｓ—Ａｒｇ一人胰岛素原；重组人胰岛素；大肠杆菌　中图分类号：Ｑ５７８；Ｑ７８６　文献标识码：Ａ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｉｎｓｕｌｉｎ　Ｌ／Ｘｉａｏ—ｈｏｎｇ，ＺＨＵ　Ｈｕｉ—ｌｉｎｇ，ＹＵ　Ｒ０　，Ｕ　Ｈｏｎｇ—ｘｉａ　（Ｗｅｓｔ　Ｃｈｉｎａ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖ．，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００４１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｏｂｔａｉｎ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｓｕｌｉｎ（ｒｈＩ），（Ｈｉｓ）６一Ａｒｇ—Ａｒｇ—ｈｕｍａｎ　ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ（ＲＲｈＰＩ）ｗａｓ　ｅｘ—　ｐｒｅｓｓｅｄ　ｂｙ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）．Ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　５　ｇ／Ｌ　ｔｒｙｐｔｏｎｅ，２　ｇ／Ｌ　ｇｌｕｔａｍｉｃ　ａｃｉｄ，７　ｇ／Ｌ　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ，０．５　ｇ／Ｌ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｓｕｌｆａｔｅ，２．５　ｇ／Ｌ　ｇｌｕｃｏｓｅ，２．７　ｇ／Ｌ　ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１００　ｍｇ／Ｌ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ，５０　ｍｇ／Ｌ　ｋａｎａｍｙｃｉｎ，　ｎａｄ　ｐＨ　７．２，ａｎｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ０．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＷｒＧ　ａｔ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ　ｐｈａｓｅ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ４　ｈ，　５　１．２　ｇ　ｗｅｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ａｎｄ　１６．２　ｇ　ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ　ｗｅｒｅ　ｈａｒｖｅｓｔｅｄ　ｆｒｏｍ　１　Ｌ　ｍｅｄｉｕｍ　ｉｎ　ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｃｅｒｔａｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂ—ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ　ｉｎ　ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｏｘｉｄｉｚｅｄ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｉｎ　ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ　ｏｓｌｕｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｈｅｌｐｆｕｌ　ｔｏ　ＲＲｈＰＩ　ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ．Ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｗｅｌｌ—ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７４　ｍｇ　ｒｈ１　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　１　Ｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅ—　ｄｉａｍ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：（Ｈｉｓ）６一Ａｒｇ—Ａｒｇ—ｈｕｍａｎ　ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｓｕｌｉｎ；Ｅ．ｃｏｌｉ　目前，国际上生产医用重组人胰岛素（ｒｅｃｏｍｂｉ—　Ｂ链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下　ｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｓｕｌｉｎ，ｒｈＩ）的方法主要有３种：　重新形成二硫键，得到ｈＩ。这一方法缺点较多，目　１）用基因工程大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，Ｅ．ＣＯ一　前已较少使用；　）分别发酵生产人胰岛素（ｈｕｍａｎ　ｉｓｎｕｌｉｎ，ｈｉ）的Ａ、　２）用基因工程Ｅ．ｃｏｌｉ发酵生产人胰岛素原（ｈｕ—　ｍａｎ　ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ，ｈＰＩ），后经加工形成ｈＩ。Ｅ．ｃｏｌｉ系统　收稿日期：２００６—０１—２０　基金项目：科技部创新基金资助项目（０６Ｃ２６２１５１００４７６）　表达量高，但缺点是不利于表达ｈＩ这样的小蛋白，　作者简介：李晓红（１９７３一），女，讲师，研究方向：微生物与生化　产物易降解，故常采用融和蛋白形式将ｈＰＩ连接在　药学．　个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂　的后加工才能形成有活性的ｈｉ；　维普资讯 http://www.cqvip.com

８０　四川大学学报（工程科学版）　第３９卷　３）通过基因工程酵母菌发酵生产ｈＰＩ，经后加　工形成ｈＩ。酵母系统下游后加工比细菌表达系统　简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分　泌量少（１～５０　ｍｇ／Ｌ），产量低。因此，虽然ｒｈＩ投放　市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效　的表达系统和高效的表达策略　Ｉ２　Ｊ，尤其是对Ｅ．ＣＯ一　尻表达系统的研究更是越来越深入，用Ｅ．ｃｏｌｉ系统　表达ｈＰＩ的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素　的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游　处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕　着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等　方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的　基因工程Ｅ．ｃｏｌｉ发酵表达（Ｈｉｓ）６一Ａｒｇ—Ａｒｇ一人胰　岛素原［（Ｈｉｓ）６一Ａｒｇ—Ａｒｇ—ｈｕｍａｎ　ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ，ＲＲｈ—　ＰＩ］，后加工成ｈＩ的制备工艺。　１　实验部分　１．１　菌种　ＲＲｈＰＩＺｐＱＥ一４０　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｍ１５菌株，按文献［３］　的方法构建。　１．２材料与试剂　ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（琼脂糖快流速阴离子交　换剂）为杭州争光树脂有限公司产品，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ一　２５为Ｓｉｇｍａ公司产品，Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５为ＧＥ公司产品，　溶菌酶、脱氧核糖核酸酶、胰蛋白酶和羧肽酶Ｂ均　为Ｓｉｍｇａ公司产品，谷胱甘肽［氧化型（ＧＳＳＧ）和还　原型（ＧＳＨ）］为上海博奥生物科技有限公司产品，　二硫苏糖醇（ＤＴＹ）为Ｏｒｇａｎｉｃｓ　Ｉｎｃ．产品，１３一巯基乙　醇和异丙基一１３一Ｄ一巯基吡喃半乳糖苷（ＩＰＴＧ）为　ＢＢ１分装，其它试剂均为国产或进口分析纯。　１．３　细菌培养和ＲＲｈＰＩ的表达　参照文献［３］，采用二级发酵的方式，用正交法　优化培养条件，并将优化条件用于发酵罐进行发酵，　收获湿菌体。　ＲＲｈＰＩＺｐＱＥ一４０　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｍ１５的发酵罐培养：将　ｌＯ　ｌＩｄ经过活化的ＲＲｈＰＩ／ｐＱＥ一４０　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｍ１５转　移至１００　ｍｌ培养基中进行培养，培养一段时间后，　将其转移至含有１．５　Ｌ培养基的发酵罐中，培养一　段时间（转速为３００　ｒ／ｍｉｎ，通气量为１：１．５～１：１．８），　过程中加人一定量新鲜的培养基并用ＮａＯＨ调节　ｐＨ，之后加入ＩＰＴＧ并升温诱导ＲＲｈＰＩ的表达，转速　随即调为４００～５００　ｒ／ｍｉｎ，增大通气量至１：１．８～１：　２．０，继续培养一段时间后，收集菌体。　１．４　包涵体的收集和洗涤　将收集的湿菌体冻存于一２Ｏ℃，然后悬浮于缓　冲液Ａ（５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ｒｉｆｆｓ—ＨＣ１，０．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，　５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１，５％甘油，０．１～０．５　ｍｍｏｌ／ＬＤＴＹ，　ｐＨ７．９）（５～６　ｍｌ／ｇ湿菌）中，加入溶菌酶（５　ｍｇ／ｇ　湿菌体），室温或３７℃振荡２　ｈ。冰浴超声１０　Ｓ×３０　次，其间每次间隔２０　Ｓ，功率为２００　Ｗ。１０℃条件下　１０００　ｇ离心５　ｍｉｎ去除细胞碎片。上清液中的包涵　体（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ，ＩＢ）在４℃条件下２７０００　ｇ离心　１５　ｍｉｎ收集，然后用含２　ｍｏｌ／Ｌ尿素的缓冲液Ａ充　分悬浮，室温静置３０　ｍｉｎ后４℃条件下１７０００　ｇ离　心１５　ｍｉｎ，收集沉淀。沉淀再用含２％脱氧胆酸钠　的缓冲液Ａ充分悬浮，４℃条件下１７０００　ｇ离心ｌ５　ｍｉｎ，收集沉淀。最后沉淀用１０　ｎｕｎｏｌ／Ｌ　ｒｉｆｆｓ—ＨＣ１，　ｐＨ　７．３洗涤两次（４℃，１７０００　ｇ离心１５　ｍｉｎ）。　１．５　ＲＲｈＰＩ的初步纯化　参照文献［４］，将收集的ＩＢ用含有０．１％～　０．３％１３一巯基乙醇的缓冲液Ｂ（３０　ｎｕｎｏｌ／Ｌ　ｓ—　ＨＣ１，８　ｍｏｌ／Ｌ尿素，ｐＨ　８．０）溶解，上于已用缓冲液　Ｂ平衡的ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ柱，用合适的氯化钠　梯度洗脱，收集含ＲＲｈＰＩ的洗脱液。　１．６　ＲＲｈＰＩ的重组复性　将初步纯化后的ＲＲｈＰＩ通过Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一２５　脱尿素，转换缓冲液为不同ｐＨ的５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｇｌｙ—　ＮａＯＨ重组液，或含有适量ＧＳＳＧ的Ｇｌｙ—ＮａＯＨ缓　冲液中，使蛋白终浓度为０．１～０．６　ｍｇ／ｍ￣，收集趋　于正确折叠的ＲＲｈＰＩ单体组分，加人适量ＧＳＨ和　ＧＳＳＧ，４℃放置２４　ｈ。　１．７酶切转化　向ＲＲｈＰＩ复性液中加入一定量的胰蛋白酶和　羧肽酶Ｂ，３７℃酶切一段时间，然后用０．１　ｍｏｌ／Ｌ　ＺｎＣ１：终止反应并沉淀生成的ｈＩ。　１．８　ｈＩ的纯化　参照文献［４］的方法。　２结果与讨论　２．１细菌培养和ＲＲ｝ＩＰＩ的表达　采用正交法，结合前期研究结果，选取影响细菌　培养和ＲＲｈＰＩ表达的主要因素（培养基组成，接种　量，种龄，通风量，诱导时间，诱导剂ＩＰＴＧ的量以及　补料方式等等），以每升培养基收获湿菌体和ＩＢ的　量为目标量进行全面优化，优化出最佳发酵条件。　实验结果表明，最优化培养基组成为５　ｇ／Ｌ胰蛋白　胨，２　ｇ／Ｌ谷氨酸，７　ｇ／Ｌ酵母浸膏，０．５　ｇ／Ｌ硫酸铵，　维普资讯 http://www.cqvip.com

第４期　李晓红，等：重组人胰岛索制备工艺　８１　２．５　Ｌ葡萄糖，２．７　Ｌ甘油，１００　ｍｇ／Ｌ氨苄青霉　素，５０　ｍｇ／Ｌ卡那霉素，ｐＨ　７．２。采用最优培养基，　在最优培养条件下（在对数生长中期加人０．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ诱导４　ｈ），用发酵罐进行发酵，通过补　料和转速调节，细菌能高效表达ＲＲｈＰＩ，实验结果见　表１。　表１　发酵罐培养的表达水平　Ｔａｂ．１　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　’ｒｅｓｔ　Ｎｏ．Ｅ．ｃｏ／ｉ　ｗｅｔ　ｗｅｉｇｈｔ／（ｇ·Ｌ一　）　ＩＢ／（ｇ·Ｌ一　）　为了使含有外源基因的Ｅ．ｃｏｌｉ旺盛生长进而高　效表达，必须提供充足而合适的营养，首先应选择合　适的碳源。由于细菌利用葡萄糖生长迅速，并且测　定方便，便于进行发酵过程的监控及发酵策略的制　定，因此葡萄糖成为Ｅ．ｃｏｌｉ发酵中最常用的碳源，但　是高浓度的葡萄糖会产生代谢副产物乙酸　抑制　Ｅ．ｃｏｌｉ的生长，从而使葡萄糖的应用受到限制。以　甘油为碳源，菌体的生长速度及呼吸强度与用葡萄　糖相差不大，且不产生乙酸，因此更易达到重组菌的　高密度及外源蛋白的高效表达，但发酵液中的甘油　定量检测方法烦琐，且价格较贵，不适于发酵条件的　筛选及实际生产中的发酵监测＿６　Ｊ。因此本研究选　取葡萄糖和甘油作为复合碳源，既可满足Ｅ．ｃｏｌｉ的　生长需要，又可降低葡萄糖的浓度，防止代谢副产物　乙酸的堆积，而且可以通过葡萄糖含量的快速测定　监测整个发酵过程，制定出合适的方案，为今后的工　业化生产做准备。　在对数生长期，细胞迅速繁殖，对营养和氧的需　求量猛增，营养和氧就成为菌群旺盛代谢的限制因　素，这时诱导将有利于外源蛋白的高效表达　。本　研究选择ＲＲｈＰＩ／ｐＱＥ一４０　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｍ１５对数生长期　的中期进行诱导，同时在高密度发酵后期，适时地提　高通气量并补加新鲜的培养基，不但改善了细菌生　长的营养状况，而且降低了代谢产物的抑制作用，提　高了目的蛋白的表达效率（每升培养基可收获菌体　５１．２　ｇ，ＩＢ１６．２　ｇ）。　２．２下游工艺　２．２．１　１３一巯基乙醇的影响　将０．６　ｇ　ＩＢ分别用含０．１％，０．２％，０．３％１３一　巯基乙醇的３０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ—ＨＣ１，８　ｍｏｌ／Ｌ尿素，ｐＨ　８．０溶解，进行ＤＥＡＥ—Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ离子交换层　析，然后将收集得到的ＲＲｈＰＩ组分通过Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　２５脱尿素以使ＲＲｈＰＩ复性。不同浓度１３一巯基　乙醇溶解的样品经过离子交换层析后，在相同的洗　脱条件下通过Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一２５进行层析，层析图谱　见图１。　（ａ）０．１％Ｂ—ｍｅｒｅａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ　（ｂ）０．２％Ｂ—ｍｅｒｃａｐｔｃｃｔｈａｎｏｌ　（ｃ）０．３％Ｂ—ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ　图１使用不同浓度Ｂ一巯基乙醇时ＲＲＩ￣Ｉ的Ｓｅｐｈａ－　ｄｅｘ　Ｇ一２５层析图谱　Ｆｉｇ．１　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ＲＲＩＬＰＩ　Ｏｉｌ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一２５　Ｗｉｔｈ　Ｂ—ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ　ａｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎ－　ｔｒａｔｉｏｎｓ　峰１为一些高分子量杂质，ＲＲｈＰＩ的二聚体及　多聚体以及折叠不正确的ＲＲｈＰＩ。峰２为趋于正确　折叠的ＲＲｈＰＩ单体。由层析图谱可以看出，随着Ｂ　巯基乙醇浓度的增大，趋于正确折叠的ＲＲｈＰＩ单　维普资讯 http://www.cqvip.com ８２　四川大学学报（工程科学版）　第３９卷　体量明显增加，在总蛋白中所占比例也明显增大。　因此选用０．３％Ｂ一巯基乙醇溶解还原样品。　２．２．２　ＧＳＳＧ的影响　当Ｅ．ｃｏｌｉ受ＩＰＴＧ和温度影响被诱导产生表达　产物ＲＲｈＰＩ时，目的基因的过度表达使蛋白没有足　够的时间折叠成天然构象，而是以无活性的ＩＢ形式　存在，而且胰岛素原分子中的三对二硫键也未能正　确配对，从而导致蛋白的深度变性（还原变性——　相对于二硫键未被破坏的变性）。因此ＲＲｈＰＩ的复　性不仅要恢复原有的氢键、疏水键，还存在二硫键的　重新对接问题。要形成有活性的最终产物ｈＩ，胰岛　素原分子中的两个链问二硫键和一个链内二硫键必　须全部正确对接，复性难度相当大。由于热力学等　原因，某些二硫键极不易形成，因此复性产物中除全　部正确对接的产物外，还可能存在多种副产物　Ｊ。　围绕提高还原变性胰岛素原等蛋白中二硫键的　正确对接率这一分子生物学中的前沿课题，人们进　行了许多探索：如在复性液中加入二硫键异构酶、分　子伴侣　－１０］等来催化二硫键的正确配对。但这些　方法条件苛刻，不易控制，而且价格昂贵。Ｒｕｏｐｐｐ—　ｌｏ【ｌ¨等人发现复性液中加入ＧＳＳＧ作为氧化剂可将　还原变性蛋白中的巯基氧化，形成蛋白一ＳＳＧ（Ｐ—　ＳＳＧ），Ｐ—ＳＳＧ可与还原蛋白（Ｐ—ＳＨ）进行反应，即　Ｐ—ＳＳＧ＋Ｐ—ＳＨ　一ＳＳ—Ｐ＋ＧＳＨ，从而完成二　硫键的配对。在ＧＳＳＧ的参与下，二硫键正确对接　的选择性提高，因而正确折叠率提高。　研究分别采用非氧化型洗脱液（５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｇｌｙ　ＮａＯＨ，ｐＨ　１０．６）和氧化型洗脱液（５０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｇｌｙ—ＮａＯＨ，ｐＨ　１０．６＋ＧＳＳＧ）进行ＲＲｈＰＩ的Ｇ一　２５层析，层析图谱见图１和图２。从图２中可以看　出，采用加入ＧＳＳＧ的氧化型洗脱液后，色谱峰变为　３个，峰２为正确折叠率高的ＲＲｈＰＩ单体，峰３为介　于正确折叠与不正确折叠的的ＲＲｈＰＩ之间的折叠　中间体。其峰２组分收集后再加入ＧＳＨ和ＧＳＳＧ能　较容易地形成具有天然构象的ＲＲｈＰＩ，从而使随后　的酶切效率也较高，因丽可有效地提高ｈＩ的最终收　率。而图１采用非氧化型洗脱液，仅形成两个峰，峰　２为正确折叠率较低的ＲＲｈＰＩ及折叠中间体的混合　峰，总体复性率较低，因此导致ｈＩ最终收率也较低。　２．２．３　对复性及酶切的主要影响因素的正交优化　由于复性液ｐＨ、ＧＳＨ与ＧＳＳＧ的比例、酶切时　间、胰蛋白酶与羧肽酶的量对复性与酶切转化有很　大影响，因此本研究对这些因素进行了全面优化。　参照文献¨　引，对影响ＲＲｈＰＩ复性及酶切转化的　３　蠹　暑　２　《　图２使用ＧｓｓＧ时ＲＲｈＰＩ的Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一２５层析图　谱　№．２　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ＲＲｈＰＩ　ｏｎ　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一２５　ｗｉｔｈ　ＧＳＳＧ　上述４个重要因素进行正交优化。试验结果表明，　酶切时间是影响ｈＩ收率的显著性因子，复性和酶切　的最优方案为：复性液ｐｉｌｌ０．８、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ为２．５　ｍｍｏｌ·Ｌ～／０．３５　ｍｍｏｌ·Ｌ～、酶切时间６０　ｍｉｎ、胰　蛋白酶与羧肽酶的量分别为１／１０００和１／２０００　ｇ　酶／ｇ蛋白。以该方案进行３次验证实验，结果见表　２。可以看出，优化后复性率及酶切效率均大为提　高，ｈＩ最终收率可达７４　ｍｇ／Ｌ，超过现有文献报道水　平（每升发酵液得ｒｈＩ约２０　ｍｇ）。　表２　ｒｈＩ的收率　Ｔａｂ．２　Ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｒｈＩ　３　结论　由ＲＲｈＰＩ制备ｒｈＩ具有表达量高，可以简化下　游纯化过程等优点　】，本研究结合前期研究结果，　选取影响细菌培养和ＲＲｈＰＩ表达的主要因素进行　全面优化，采用甘油和葡萄糖组成的复合碳源，细菌　能高效表达ＲＲｈＰＩ。　在ＧＳＳＧ的参与下，ＩＢ复性时二硫键正确对接　的选择性提高，因而复性率提高。本研究将ＧＳＳＧ　加至Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ一２５层析洗脱液中，出现正确折叠　率极高的ＲＲｈＰＩ单体峰，收集此峰进行下一步的酶　切，ｈＩ的收率明显提高。同时，ＧＳＳＧ作为一种流动　相添加剂，可增强洗脱液的洗脱能力，从而阻止　维普资讯 http://www.cqvip.com

第４期　李晓红，等：重组人胰岛素制备工艺　８３　ＲＲｈＰＩ在Ｇ一２５柱上的聚集沉淀，保护层析柱Ｌ１引。　本研究还发现，在较高浓度（０．３％）的ｐ一巯基乙　醇作用下，ＲＲｈＰＩ中的二硫键被打开，并在空气中缓　［７］Ｚｈａｎｇ　Ｘ　Ｗ，Ｓｕｎ　Ｔ，Ｈｕａｎｇ　Ｘ　Ｎ，ｅｔ　ａ１．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｆｅｄ·－ｂａｔｃｈ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅ·－　慢氧化逐渐复性，也可使ＲＲｈＰＩ单体量增加。进一　步提高ｐ巯基乙醇的量则会使成本提高。　通过上下游工艺的全面优化，本研究将ｈＩ的最　终收率提高到７４　ｍｇ／Ｌ。工艺简单，具有很高的应　ｒｉｅｈｉａ　ｃｏｉ［Ｊ］．Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｌｅｒｏｂ　Ｔｅｃｈｎｏｌ　１９９９，２４：６４７—　６５０．　［８］Ｈｏｂｅｒ　Ｓ，Ｆｏｒｓｂｃｒｇ　Ｇ，Ｐａｌｍ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｄｉｓｕｌｉｆｄｅ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｆｏｌｄｉｎｇ　ｏｆ　ｉｎｓｕｌｉｎ—ｉｌｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　Ｉ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　用价值。　参考文献：　［１］Ｃｈｕｌ　Ｓ　Ｓ，Ｍｉｎ　Ｓ　Ｈ，Ｃｈｅｏｎ　Ｓ　Ｂ，ｅｔ　１ａ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｒｏｄｕｅ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｍｉｎｉ—ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ　ｉｎ　ｆｅｄ　ｂａｔｃｈ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ａｔ　ｈｉｓ｝ｈ　ｃｅｌｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｅｓｅｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃｏｉｌ　ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥＴ一３ａ　Ｔ２Ｍ２］［Ｊ］．Ｂｉｏｔｃｅｈｎｏｌ　Ｐｒｏｇ，１９９７，１３：２４９—２５７．　［２］Ｇｕｏ　Ｙ　Ｚ，Ｓｈｅｎ　Ｘ　Ｚ．Ｈｉｇｈｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ　ｉｎ　Ｐｉｃｈｉｃ　ｐａｓｔｏｒｉｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｇ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｃｅｈｎｏｌ，１９９９，１９（６）：６４　６７．［郭永志．沈孝宙．人胰岛素原在甲醇酵母中的高　效表达［Ｊ］．生物工程进展，１９９９，１９（６）：６４—６７．］　［３］Ｌｉ　ｘ　Ｈ，Ｙｕ　Ｒ，Ｚｅｎｇ　Ｒ，ｅｔ　ａ１．Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　（Ｈｉｓ）６一Ａｒｇ—Ａｒｇ—ｈｕｍａｎ　ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ　ｉｎ　Ｅｓｅｈｅｒｉｅｈｉａ　ｃｏｉｌ　［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３，１０（３）：１４４—１４８．　［４］Ｙｕ　Ｒ，Ｌｉ　Ｘ　Ｈ，Ｙａｎｇ　Ｊ　Ｙ，ｅｔ　１ａ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ｉｎｓｕｌｉｎ－－ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ　ｐｒｏｃｅｓｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｍｅｄ　Ｅｎｇ，２００４，２１（５）：８０５—８０８．［余蓉，李晓红，杨继虞，等．　重组人胰岛素的制备一下游纯化工艺的研究［Ｊ］．生　物医学工程学杂志，２００４，２１（５）：８０５—８０８．］　［５］Ｐｒｉｍｂｏｓｅ　Ｓ　Ｂ，Ｄｅｒｂｙｓｈｉｅｒ　Ｐ，Ｊｏｎｅｓ　Ｉ　Ｍ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｅａ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　［Ｊ］．Ｃｏｎｔｉｎ　Ｃｕｌｔ　Ｂｉｏｔｃｅｈｎｏｌ　Ｍｅｄ　Ｅｎｖｉｏｒｎ，１９８４，８：２１３—　２１９．　［６］Ｙａｎｇ　Ｒ　Ｙ，Ｌｉ　Ｍ，Ｃｈｅｎ　ＣＨ　Ｑ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｉｔｏｎ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚａ－　ｔｉｏｎ　ｏｆｇｌｙｃｅｒｏｌ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｉｓｈ　ｄｅｎｓｉｙｔ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆｇｅｎｅｔ－　ｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｅｒｏｂ，１９９９，２９　（１）：２５—２８．［杨如燕，李民，陈常庆．基因工程菌高密度　发酵液中碳源物质甘油的定量检测及其浓度的优化控　制［Ｊ］．工业微生物，１９９９，２９（１）：２５—２８．］　１９９２，３１：１７４９—１７５６．　［９］Ｒｕｏｐｐｏｌｏ　Ｍ，Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ—Ｌｉａｒｓ　Ｊ，ＴＭａｍｏ　Ｆ，ｅｔ　１ａ．Ｅｆｆｅｃｔ　ｆｏ　ｌｇｕｔａｒｄｏｘｉｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｉｓｕｌｉｆｄｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｕｔａ—　ｈｔｉｏｎｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｆｏｌｄｉｎｇ　ｏｆ　ｉｒｂｏｎｕｅｌｅａｓｅ　Ａ［Ｊ］．Ｂｉｃｏｈｅｍｉｓ—　ｔｒｙ，１９９７，３６：１２２５９—１２２６７．　［１０］Ｒｏｚｅｍａ　Ｄ，Ｇｅｌｌｍａｎ　Ｓ　Ｈ．Ａｒｔｉｉｉｅｌｌａ　ｃｈａｐｅｒｏｎｅ—ａｓｓｉｓｔｄｅ　ｒｅ—　ｆｏｌｄｉｎｇ　ｏｆ　ｄｅｎａｔｕｒｅｄ—ｒｅｄｕｃｅｄ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｒｅｎａｔｕｒａｉｔｏｎ　ａｎｄ　ａｇｇｒｅｇａｉｔｏｎ［Ｊ］．Ｂｉｏ－　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，３５：１５７６０—１５７７１．　［１１］Ｒｕｏｐｐｏｌｏ　Ｍ，Ｆｒｅｅｄｍａｎ　Ｒ　Ｂ．Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ　ｂｙ　ｄｉｓｕｌｉｆｄｅ　ｉｓｏｍ—　ｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ｔｈｅ　ｍｉｘｅｄ　ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｒｉｂｏｎｕｅｌｅａｓｅ　Ｔ１　ａｎｄ　ｌｇｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ａｓ　ａ　ｍｏｄｅｌ　ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ［Ｊ］．Ｂｉｃｏｈｅｍｉｓ－　ｔｒｙ，１９９５，３４：９３８０—９３８８．　［１２］Ｃｈｅｎ　Ｌ　Ｔ，Ｚｈａｎｇ　Ｍ　Ｊ，Ｈｕ　Ｍ　Ｈ．Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｈｔｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｉｎｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ａ　ａｎｄ　Ｂ　Ｃｈａｉｎｓ　ｏｆ“Ｍｉｎｉ—Ｃ’’ｈｕｍａｎ　ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ　ｎａａｌｏｇ　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｆｏ　Ｂｉｃｏｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｓｅ，２ＯＯＯ，２１（５）：２１７—２１９］　［陈来同，张明军，胡美浩．小ｃ肽人胰岛素原类似物（Ｂ　Ａｒｇ—Ａ）和人胰岛素原（Ｂ—ｃ—Ａ）Ａ，Ｂ链重组　条件的研究［Ｊ］．中国生化药物杂志，２０００，２１（５）：２１７—　２１９］　［１３］Ｋｅｍｍｌｅｒ　Ｗ，Ｐｅｔｅｍｏｎ　Ｊ　Ｄ，Ｓｔｅｉｎｅｒ　Ｄ　Ｆ．Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ　ｔｏ　ｉｎｓｕｌｉｎ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９７１，　２１６：６７８６—６７９１．　［１４］Ｒａｍａｎ　Ｂ，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ　Ｔ，Ｒａｏ　Ｃ　Ｍ．Ｒｅｆｏｌｉｄｎｇ　ｏｆ　ｄｅｎａ—　ｔｕｒｅｄ　ａｎｄ　ｄｅｎａｔｕｒｅｄ／ｒｅｄｕｃｅｄ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ　ａｔ　ｈｉｓｈ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａ—　ｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｄ　Ｃｈｅｍ，１９９６，２７１：１７０６７—１７０７２．　（编辑黄ｄ＇ｄｌ１）